人色氨酸(Tryptophan,Trp)ELISA Kit/Human Tryptophan,Trp ELISA Kit

1.实验原理：

本试剂盒采用竞争法(间接法)检测样本中色氨酸（Trp）的含量。向预先包被了相关抗体的酶标孔中加入样本，再加入辣根过氧化物酶标记的识别抗原，在37℃下孵育1小时，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤后，结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。

2.试剂盒组成：

备注：

a． 试剂盒中“样品稀释液”为0.05M的PBS，“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。

b.不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。

c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。

3试剂盒保存

本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。

4．需要而未提供的试剂和器材

1． 37℃恒温箱。

2． 标准规格酶标仪。

3． 精密移液器及一次性吸头

4． 双蒸水或超纯水

5． 干净的试管或Eppendof管

6． 吸水纸

7． 自动洗板机或8道排枪

8． ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc

9． 500ml烧杯的和适当量程的量筒

5.试剂准备

a.      使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。

b.     本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。

c.      洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。

d.     标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上3.2μmol/L,1.6μmol/L, 0.8μmol/L,0.4μmol/L,0.2μmol/L.取150μl标准品原液加入标记3.2μmol/L的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）

    原液6.4μmol/L   3.2μmol/L   1.6μmol/L   0.8μmol/L   0.4μmol/L    0.2μmol/L

6.样本前处理

a.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
b.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
c.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
d.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
e.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
f.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

7.洗板方法

a.      手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。

洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。